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提取動物組織細胞DNA基因組的方法

發布時間:2014-3-3 14:15:27??????點擊:

一、實驗原理
真核生物的一切有核細胞(包括培養細胞)都能用來制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內,因此,制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離,又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質,再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質,得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應體系中,SDS可破壞細胞膜、核膜,并使組織蛋白與DNA分離,EDTA則抑制細胞中Dnase的活性;而蛋白酶K可將蛋白質降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分離出來。
二、儀器及試劑
1. 儀器:
恒溫水浴鍋、臺式離心機、紫外分光光度計(GeneQuant)、移液器、玻璃勻漿器、離心管(滅菌)、吸頭(滅菌)

三、操作步驟
1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g(0.5cm3),盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中,加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊,轉入1.5ml 離心管中,加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl,混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min,也可轉入37℃水浴12~24h,間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min,取上清液入另一離心管中。
2.加2倍體積異丙醇,倒轉混勻后,可以看見絲狀物,用100ul 吸頭挑出,涼干,用200ul TE 重新溶解。(可進行PCR反應等,需要進一步純化的按下列步驟進行)
3.加等量的酚:氯仿:異戊醇振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。
4.取上層溶液至另一管,加入等體積的氯仿?異戊醇,振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。
5. 取上層溶液至另一管,加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇,混勻后室溫沉淀2min ,離心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次,離心12000 rpm , 5min。
8.小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉,室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存備用。
10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。
四、常見問題
1.選擇的實驗材料要新鮮,處理時間不易過長。
2.在加入細胞裂解緩沖液前,細胞必須均勻分散,以減少DNA團塊形成。
3. 提取的DNA不易溶解:不純,含雜質較多;加溶解液太少使濃度過大。沉淀物太干燥,也將使溶解變得很困難。
4. 電泳檢測時DNA成涂布狀:操作不慎;污染核酸酶等。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8;不純,含有蛋白質等雜質。在這種情況下,應加入SDS至終濃度為0.5%,并重復步驟2~8。
6.酚/氯仿/異戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸取:含高濃度的DNA,可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。

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